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液相色谱柱的十个误区
2018-09-09 09:25
液相色谱柱的十个误区

误区1:空气会彻底毁灭一根HPLC色谱柱——假!

 

  当色谱柱不与色谱仪连接的时候,用户需确保色谱柱被紧紧地密封。事实上实际的应用中是,即使柱的端部进入了少量的空气也不要紧。因为当你将色谱柱连接到色谱仪上使用时,在系统初始加压阶段,在很短的时间内空气就会被溶剂冲刷掉。

  误区2:所有的C18(L1)色谱柱都是一样的——假!

 

  美国药典委员会(USP)开发了一种分类系统,用来对每种类型的键合相柱进行分类。由于C18色谱柱是一种广泛应用的色谱柱,故该系统将其称为“L1”。可惜不幸的是,大约有800种以上的L1流入了市场,因此,事实证明这个系统是不可靠的,是一个令人困惑的系统。

  误区3:反相色谱柱不可以使用纯水相——假!

 

  这个误解其实是起源于有些用户在使用低有机溶剂含量或者纯水作为反相色谱柱的流动相时,发生了俗称相塌陷的现象,所以大家就认为反相色谱柱不可以使用纯水相。许多色谱工作者都被相塌陷现象和保留时间位移现象困扰着,甚至已经失去了努力寻找解决途径的耐心。因此,他们索性就认为不应该在反相色谱柱中运行水含量很高的流动相。然而,事实上市售的反相色谱柱(如极性嵌入和极性封端柱)都是具有水浸润性的,其表面特性是允许使用纯水的,而不会导致塌陷或者保留时间移位。

  误区4:至少需要10个柱体积才能重新使LC色谱柱达到平衡——假!

 

  平衡时间对于梯度色谱来说非常重要的,因为它是整个技术的限制因素。这有两种平衡类型:重复平衡和完全平衡。重复平衡也就意味着在无法实现完全平衡的情况下达到的平衡。实际上,如果在随后的运行中,保留时间的重复性是小于0.002 min的,然后对于非离子化溶质的无缓冲洗脱剂和碱性化合物以常用的三氟乙酸和甲酸为添加剂的话,重复平衡在两个柱体积的范围内即可实现。

  误区5:相较之纯的多孔粒子,表面多孔颗粒会显著降低样品容量——假!

 

  HPLC色谱柱填料对样品的容量是与其表面积成正比的,这与硅醇基通过单体键合形成的化学键合相的量相关。然而,研究结果表明:在相同的试验条件下,表面多孔颗粒与多孔粒子对样品的容量是基本上相同的。

  误区6: UHPLC填料柱比常见的HPLC填料柱更容易堵塞——假!

 

  随着柱填料多孔材料粒径的不断减小,使得柱的主要硬件设计跟着一起发生变化。对于sub-2µm UHPLC柱的堵塞,是样品和流动相物质倒伏在柱入口的结果。如果你在进样前对样品进行了净化如使用固相萃取、过滤或离心等,就可以避开任何污染问题。

  误区7:保护柱是没必要的——假!

 

  使用保护柱有很多好处。首先,保护柱可以防止化学物质或颗粒物损坏分析柱。其次,相较之更换一根昂贵的分析柱,更换一根5mm 的保护柱只需要很少的花费。现代的保护柱具有几乎无死体积、更换快速,以及适用于UHPLC的高压等优点。

  误区8:你不可以将HPLC色谱柱反接以便于冲洗掉其中的颗粒物——假(但有时真)!

 

  实际上HPLC色谱柱的填装压力比最大使用压力高很多(通常会高2倍)。如果装柱时使用了恰当的匀浆剂,并且分配一定的时间使柱床稳定,一支填装良好的色谱柱是完全可以双向使用的。

  反向使用色谱柱有一个例外,就是生产商在色谱柱的进样端使用了孔径更大筛板的情况,反向使用可能会将填料从柱床冲出。如果制造商在柱的入口处使用的是高孔隙率的玻璃料,那么将柱反冲的话,可能会将柱填料从填充床上冲洗掉。色谱柱在工厂填装时,出口端的筛板孔径必须比色谱柱中最小颗粒的粒径还要小。譬如,色谱填料平均粒径是5μm,粒径分布范围是3-7μm,出口端筛板孔径必须小于3μm,使填料没有可能从柱床跑到色谱柱筛板外面。大多数生产厂家选择的筛板孔径是2μm。 至于某些厂家两端的柱筛板孔径不一样,一般是进样端大些,出样端小些。因此,一些制造商会在柱子标签处放置一个箭头指示,表明必须仅在一个方向上使用。可以肯定有这种可能性,所以一个色谱工作者应该好好阅读色谱柱手册或说明书,或与制造商确定这根色谱柱是否可以反冲。

  误区9:色谱柱填料粒径越小、压力越高,分离效果越好——假!

 

  超小的粒径以及超高的柱压,并不一定是色谱工作者的最佳选择!

  现代色谱柱的柱特性研究已经引发出一些新方法来评估一根色谱柱的性能。例如,采用新的表面多孔材料的色谱柱,其柱效与sub-2µm UHPLC柱效一样好,然而与常规的LC填料色谱柱比起来,柱压很低。

  误区10:柱压不会影响色谱分离效果——假!

 

  色谱的很多参数都是受柱压影响的,包括部分溶质的摩尔体积、停滞体积、柱孔隙度、保留因子、流动相密度、介电常数、固定相结构、pH和电离常数等。为什么柱压引起了越来越多的关注呢?原因是市售的色谱仪很多是超高压色谱仪和色谱柱。当色谱柱在约13.789MPa压力下运行时,即使保留时间上存在小差异,也并不会引起我们的注意;特别是如果重复性较好及定量不受影响的时候。但是,当柱压接近13.789MPa时,柱压的影响可能就相当明显了。

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